返回首页
设为首页
加入收藏夹
进入病理技术论坛
首页 技术精华 病理资讯 同行交流 技术会诊 点滴经验 常规切片 特殊染色 免疫组化 分子病理 细胞园地 细胞制片 电镜技术 病理图库
 首页 > 分子病理 > 正文
基因诊断技术方法分类

时间:2007-12-24  作者:microfox  阅读:16592次
(1)诊断技术分类
 1)根据目的基因是否被放大分类  可分为杂交法和扩增法。前者被检测的目的基因不被放大,如分支链DNA技术,但用杂交法可以进一步检测经过放大了的基因片段,如PCR产物杂交分析;后者包括PCR及连接酶链反应,Qβ复制酶系统等。
 2)根据被测基因的核酸类型分类  ①在杂交法中,Southern印迹用于检测DNA;Northern印迹用于检测RNA;斑点印迹或称斑点杂交,既可检测DNA也可检测RNA。②PCR法主要用来直接扩增DNA,但是通过逆转录技术,可以将RNA先转变为cDNA再行扩增,称逆转录PCR,如检测HCV、HGV、HIV等。③原位杂交,或原位PCR,也可分DNA或RNA原位杂交和原位PCR或原位逆转录PCR。
 3)根据是否提高了敏感度分类  分支链DNA技术(bDNA),就是根据固相杂交的原理,采用了一种放大标记探针,目的探针不被放大,但检测信号被放大,从而提高了敏感度;套式或巢式PCR,是用两套引物(内、外引物)作两轮PCR,第二轮PCR是以第一轮PCR的产物作为模板,敏感度进一步提高,常用于极微量病毒基因检测,如检测TT病毒,以及检测大多数RNA病毒(称逆转录套式PCR)。
 4)根据待测标本的性质  分体液(血、尿、粪、痰液、胸腹水等等)、细胞和组织基因检测。①体液中的待测基因可在将标本适当处理后,根据需要采用上述各种方法检测;②组织切片内基因检测则可采用原位杂交和原位PCR法;③细胞内病原体基因检测可以通过细胞裂解,释放了待测基因后,采用与体液检测相同的方法,也可将细胞固定于一定载体上,如玻片,或硝酸纤维膜上(如平板上细菌菌落内的基因鉴定),采用类似于组织基因测定的方法。
 5)根据诊断目的或要求  分为定性诊断、定量诊断和半定量诊断,以及序列分析等。
(2)基因诊断的策略
  1.从基因产物入手  这是一种比较早期的诊断策略。首先分析异常基因的产物(蛋白质),并弄清是如何引起临床症状的。在纯化了该蛋白质以后,进行氨基酸序列测定,据此合成寡核苷酸探针,从互补DNA(cDNA)文库或基因组文库中筛选克隆,然后通过DNA序列分析确定导致疾病的分子缺陷。这种策略是由蛋白质至DNA,由表型至基因型。迄今分离的绝大部分分子病和遗传性代谢缺陷病如白化病、苯丙酮尿症(PKU)和镰状细胞贫血等的相关基因都是根据这一策略分离的。
 2.从基因定位入手 根据遗传连锁图将致病基因定位在染色体的某一具体位置上,这种基因定位和克隆的策略称为定位克隆。比较正常和异常基因的差别,就可找出导致遗传病的分子缺陷,进而阐明正常和异常基因产物(蛋白质)的生理功能和病理效应。常用于染色体上基因定位的遗传标记有限制片段长度多态性(RFLP)、可变数目串联重复序列(VTR)、短串联重复序列(STR)及近年来发展起来的单核苷酸多态性(SNPs)等。
 3.从比较正常和异常基因的差异入手 临床上较常见的一些遗传病如糖尿病、重度肥胖、哮喘、精神病等都是由多个疾病基因与有害环境因素相互作用的结果。比如,已定位的2型糖尿病易感基因有10多个,其中单个基因的作用是微小的,但存在累加效应。对于这些复杂遗传病,目前主要采用表型克隆方法进行诊断。表型克隆是将表型与基因结构或基因表达的特性结合起来,直接分离该表型的相关基因。这种策略既不用事先知道基因的生化功能或图谱定位,也不受基因数及其相互作用方式的影响。
(3)方法和原理
  1.杂交法
 1).原理
   杂交技术的基本原理是相同的。病原体基因的一级结构中都含有四种碱基:DNA为腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T),RNA为腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)。在双链DNA或RNA中这四种碱基以固定关系配对,即A-T(或A-U),C-G,这种碱基配对关系就构成了DNA或RNA两条链的互补关系,也就是说,两条链之间是严格地通过A对T(或A对U)、C对G的关系结合在一定的。在一定的温度下,这两条链可以打开,变成分离的两条链,但又可以在一定温度下结合起来,这种"再结合"仍然遵循互补原理,但是再结合时的两条互补链是随机碰撞而形成双链的,也就是说再结合后的两条链已经不再是"元配"的了,"杂交"一词就由此而来。如果我们在一条链上"打上标记",并用它去与另一条链杂交,如果另一条链的确存在,就必然会发生杂交反应,杂交体(新的双链)上也就会被同样带上了标记,再用特定的技术可以探测到标记信号。
 2).方法
   杂交法中最关键的技术是制备标记探针。标记探针的制备过程包括探针的制备和探针的标记两部分,可分别亦可同步进行。常用的方法有切口平移法、随机引物法、末端标坊法、单链探针制备和标记等。目的还有应用比较广泛的寡核苷酸标记探针,即在寡核苷酸化学合成过程中将标记物(放射性的或非放射性的)掺入或修饰在探针上。
 (1)斑点杂交:将待测标本用点状加样法,直接滴加膜上,然后用碱溶液使核酸变性并结合在膜上,再经中和及烘烤(尼龙膜可用紫外线照射)后,与探针进行杂交。
 (2)Southern印迹:又称凝胶电泳印迹转移杂交。是电泳技术与杂交技术结合的一种方法。先将待测标本病原体DNA分离,经限制性内切酶消化成一系列片段,进行琼脂糖凝胶电泳,各片段因分子量不同而彼此分开,然后经碱处理凝胶,使DNA的片段变性,在原位将单链核酸吸印到硝酯纤维膜上,经烘干、固定,以放射性核素标记DNA探针进行杂交,最生洗膜和放射自显影,从显影区带鉴定待测标本DNA片段。
 (3)Northern印迹:是指RNA(主要mRNA)的分子杂交技术。其原理和操作过程基本上与Southern印迹法相同。差别在于电泳标本是RNA片段,使用的探针是标记的DNA。
 (4)原位杂交:是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种特殊技术。用标记核酸探针,与细胞涂片、压片、细胞悬液滴片或组织切片上具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构,然后通过放射自显影或酶底物显色或激发荧光等方法检测特定的核酸分子所在的部位。由于本法不需从细胞中提取核酸并可直接观察待测核酸所在的细胞类型、细胞内分布状态与细胞染色体的关系,因此常是检测病毒与细胞关系的极好方法。
 (5)微反应板杂交:杂交反应的载体不是硝酸纤维膜或尼龙膜,而是微孔反应板,操作方便,敏感度高。此法快速、简便,不需先抽提核酸,一次可检测大量标本,已广泛用于检测血清或肝组织中HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA等。该技术近年来发展较快,预计将取代斑点印迹法。
 2.扩增法 PCR法
 1).原理
   利用耐热的DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶等)在体外条件下,催化一对引物间的特异DNA片段合成。它包括变性、退火、延伸三个过程。这3个过程组成一个循环周期,上一个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板,如此循环往复,经过n个循环后,靶DNA的拷贝数呈2n增长,可把靶DNA的拷贝数扩大百万倍以上。
 2).方法
 (1)标本处理:作为PCR的待测标本,单链、双链DNA或RNA均可。如以RNA为起始标本,则需先通过逆转录获得cDNA第一链后才能扩增,此即逆转录PCR(RT-PCR)法。标本中不能混有任何外源和内源性蛋白酶(可降解Taq DNA聚合酶)、核酸酶、DNA多聚酶的抑制剂或能结合DNA的蛋白质。
(2)引物设计:由于引物决定扩增片段的特异性,因此它必须对致病微生物是特异的。可通过计算机进行致病微生物基因资料分析,先选出致病微生物基因组中具有相对独立性与保守性的序列,再设计与该序列两端互补的寡核苷酸片段进行人工合成。
(3)扩增条件:须注意dNTP浓度、Taq酶的质量、引物用量、镁离子浓度、反应温度与时间、实验环境、器材质量等,这些都影响PCR结果的质与量。尤为重要的是要严格预防产物污染,以避免假阳性。
(4)PCR产物检测:根据检测目的不同可以选择琼脂糖凝胶电泳染色法、Southern印迹转移、酶切图谱分析法、序列分析法和PCR-ELISA。
3.基因定量诊断
   基因定量是在基因定性诊断技术基础上发展起来的,但历史不长,应用范围亦有限。目前主要用于数种病毒基因的定量分析,如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒(HIV)等。基因定量诊断可用于病情评估、疗效预测和观察及预后判断等,故有重要的临床应用价值。随着基因定量技术和方法的不断完善,其应用范围也将不断扩展。
 1.杂交定量分析
(1)分支链DNA信号放大技术(bDNA):该技术系美国Chiron公司的专利。检测系统中的主要成分是5组功能不一的人工合成的寡脱氧核苷酸探针,其中标记放大探针是技术的关键。bDNA技术有以下优点:①灵敏度高。其cut-off值为700000Eq/ml;②阳性检出率高。Chiron的第二代bDNA系统将检测探针的针对性扩展到HBV基因的各种亚型和突变型;③稳定性和可重复性好;④操作简便、省时、易于普及。国内已有一些医院采用bDNA技术进行HBV基因和HCV基因检测。
(2)液相分子杂交:分别由美国的Abbott实验室和芬兰的Orion公司建立。其基本原理是将放射性同位素掺入标记探针,与待检基因在液相中杂交,然后经过吸付洗脱或过柱注脱,分离游离和结合探针,测定结合探针部分的放射活性。
(3)双抗体夹心杂交法:采用两种抗DNA/RNA杂交体的抗体:一抗为捕获抗体,直接吸附在微孔反应板上,二抗是标记抗体,偶联有AP,可通过酶促化学发光反应检测DNA/RNA杂交体的信号。
(4)微反应板酶联杂交 由我们实验室建立,方法上与bDNA相似,但在信号放大探针制备方式上有其独到之处,获得了国家发明专利。目前主要由于定量分析HBV基因组,敏感度比bDNA略低,但不需要特殊仪器,可普及化等是其优势。与上海绿谷伟业生态工程公司合作生产的试剂盒不久将在国内问世。
2.PCR基因定量技术
基本原理同PCR定性技术,方法上计有终点稀释法、外参照法、荧光PCR、PCR-ELISA等。竞争PCR的基本原理则是在定性PCR的基础上,在扩增反应管内加入了一种称之为内参照的竞争模板,可以与野生模板即目的片段等效地被扩增。内参照是决定分析系统是否可靠和稳定的关键因素。
  竞争PCR-ELISA法,采用一种独特和简便的技术,制备与目的片段等长的内参照,内参照中还含有杂交位点,这个杂交位点与目的片段的相应位点有近乎完全相等的杂交参数,该制备技术获得国家发明专利。利用该技术定量检测HBV DNA,有精确、简便、迅速、敏感的特点。



参考文献:
1、王伯沄,李玉松,黄高升,张远强《病理学技术》
2、凌启波《实用病理特殊染色和组化技》
3、刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》
本栏目内容只供网友们学习研究用,不得用于商业行为。

【字体: 】【发表评论】【打印】【关闭
ico 论坛最新贴子
关于我们
  本站自1998年成立以来首次改版,从病理技术方面做全做深,新增了病理技术理论知识、病理资讯、病理图库及技术精英等功能。我们的宗旨是传播一种积极的思想,提供一些理论和实践的知识,为朋友们解决一点实际的问题,想您所想的,关心您关心的,希望病理技术网能成为全国病理工作者学习和交流的场所。
© Copyright 1998-2017 杭州游刃文化艺术策划有限公司,All Rights Reserved.
业务联系:DingWei(QQ:891232) 广告联系:CoastChen (QQ:37784) 技术支持:12900.COM