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染色

时间:2007-12-23  作者:丁伟  阅读:38432次

一、染色的作用
染色的作用是为了提高标本各部分在光学显微镜下的分辨率。
未经染色的组织切片和细胞涂片不能直接在光学显微镜下观察。即使是显微镜有足够的分辨率和合适的放大倍数,还必须要求标本各部分结构对光的折射率有较显著的差别,方能加以辨认。


二、生物染料
染料从来源上可分为天然染料(如苏木精、卡红、巴西木精)和人工合成染料;从化学组成上可分为无机染料和有机染料。我们常用的染料主要是人工合成的煤焦油染料,它主要是含主香碳环和杂环的有机化合物。这些有机化合物必须自身具有颜色,同时与被染物质分子间有一定的亲和力方能称为染料。我们知道,染料的颜色和与被染物分子间的亲和力是由染料的分子结构决定的。在染料分子中有使其产生颜色的发色团和使染料颜色加深的并与被染物质间产生亲和力的助色团。
(一)发色团
使有机分子产生颜色的含有不饱和键的基团称为发色团也称生色团。将发色团引入分子之后可使有机化合物选择性吸收光谱向长波长移动,即从肉眼不可见的紫外光区移向可见光区,从而使分子显色。有机分子中引入发色团有可能使有机化合物显色,但在有机分子中仅仅有发色团并不一定就显示颜色,还要看发色团被引入有机分子后,是否使有机分子形成较大的共轭体系,共轭程度越大颜色越深。有颜色的有机分子必需引入助色团,才能与被染物分子产生亲和力,使被染物着色,因此把有发色团又有助色团的有机化合物称为染料。
(二)助色团
能够使染料分子颜色加深,极性加大,并与被染物质分子间形成亲和力的基团称为助色团。使染料分子与被染物质分子间产生亲和力是助色团最主要的作用。助色团使染料分子色度加深、染料分子极性增强,易离子化。
助色团多为极性基因,有的还具有酸碱性,如—OH与苯环相连有弱酸性,—NH2及其取代物具有碱性,—SO3H具有强酸性,—COOH具有弱酸性,这些基因引入有机分子之后不仅增强其极性而且与碱或酸成盐,易溶于水并电离成正负离子,促进染料与被染物分子间的结合。


三、染料的分类
1、天然染料
2、合成染料(又称煤焦油染料)
合成染料都是从煤焦油中提取苯的衍生物。它还可以按其分子中所含的发色团现分为九大类(或十大类)。
(1)亚硝基染料类
发色团为亚硝基(—NO),如萘酚绿—B
(2)硝基染料类
发色团为硝基(—NO2),如苦味酸,萘酚黄—S,马汀黄。
(3)偶氮染料
发色团为偶氮基(—N=N—)。这一类染色剂很多。常用的有偶氮红,刚果红,偶氮焰红,丽春红,俾士麦棕,橙黄-G,苏丹I-Ⅳ,苏丹黑-B,油红-O等。
(4)重氮盐类
(5)醌亚胺染料
这类染料分子中含有两个发色团,一个是亚胺基及一个醌基常用的有:中性红,美蓝,,尼罗蓝、天青石蓝甲苯胺蓝,硫堇、亚甲绿、萘酚蓝、沙黄、亚甲紫、天青、焦油紫等。
(6)苯甲烷类染料
发色团为醌基,分子结构中一个碳原子上连有两个苯基和一个醌基。
常用的有:碱性品红,酸性品红,苯胺兰,二甲苯蓝,依思明蓝,亮绿,碘绿,黄色浅绿—SF,孔雀绿,甲基绿,结晶紫、霍夫曼紫、乙基紫,尤胆紫(无水结晶)、甲基紫等,如:孔雀绿的结构。
(7) 叮类染料
发色团为醌基。
(8)蒽醌染料
发色团为醌基。
(9)噻唑类染料
发色团为胺基,偶氮基等。
(10)喹啉类染料
发色团为醌型结构喹啉环。常用的喹啉类染料为花青素(喹啉蓝)。
3、无机化合物
除了天然染色剂和合成染色剂之外,在生物染色中还使用一些无机化合物,如氯化金、硝酸银、碘、高锰酸钾等。
(二)根据染料的化学反应分类
因为助色团有酸性助色团和碱性助色团之分,故染料也就相应地有酸性染料和碱性染料之别。
1、酸性染料
酸性染料不是指其水溶液一定显酸性。而是指含有酸性助色团与碱作用成盐,其水溶液电离出的有色离子为阴离子染料为酸性染料。酸性染料是一类色酸盐,含有酸性助色团,常与碱作用生成钠盐、钾盐、钙盐或铵盐,一般溶于水和乙醇。多作为胞浆染色剂。常用的有伊红、酸性品红、苦味酸、刚果红、甲基蓝、水溶性苯胺兰、坚牢绿-FC和橙黄-G等。
2、碱性染料
是一类色碱。含有碱协助色团,其水溶液不一定显碱性,而是与酸能成盐,如与硫酸、盐酸成盐,电离后有色离子为阳离子,这类染料一般能溶于水和乙醇。多作为胞核染色剂。常用的有苏木红(天然染料)、美蓝、中性红、甲基绿、孔雀绿、甲苯胺蓝、尼罗蓝、沙黄等。


四、染色的物理作用和化学作用
染料和被染物结合而着色的过程是相当复杂的。如染料与被染物之间的相互作用,染料与助染剂之间,染料与溶剂之间,被染物与溶剂之间,都存在一定的相互作用和影响。在染色过程中染料与被染物之间既存在物理作用,又存在化学作用,是二者合作用的结果。
(一)物理作用
染色的物理作用包括毛细现象,吸附作用和吸收作用。
1、毛细现象
毛细现象又叫毛细管作用。含有细微缝隙的物体与液体相接触时,液体靠表面张力沿细微缝隙上升或扩散的现象叫毛细现象。缝隙越细毛细现象越显著。内径小到足够引起毛细现象的管子叫毛细管。组织有许多的微孔,就可借助毛细管作用与染料接触,这是纯粹的物理作用,相当于混合,结合得不牢,不能称为染色,但染色过程它是第一步。
2、吸附作用
吸附是指物质在相界面上浓度自动发生变化的过程,是一种物质从它的周围把另一种物质的分子、原子、离子集中在界面上的过程叫吸附作用。具有吸附作用的物质叫吸附剂,被吸附的物质叫吸附质或吸附物。吸附作用又分物理吸附和化学吸附。
物理吸附是由于范德华力引起的,作用力弱、吸附为多分子层、无选择性。吸附热小,吸附速度快。化学吸附是由于形成化学键的结果。作用力强,是单分子层吸附、有选择性、吸附热大、吸附速度慢。在低温下进行的吸附一般都是物理吸附。化学吸附常在较高的温度下进行。
3、吸收作用
吸附质如果进入了吸附剂的内部并均匀地分布在其中,这种现象又称为吸收。
4、分子间的作用力
分子间的作用力是由范德华(Van der walls)第一个提出的,所以把这种力叫范德华力。
(二)化学作用
组织和细胞内化学物质的分子内含有酸性、碱性和两性基团。在一定条件下,被染物质的分子以这些基团与染料分子的助色团发生化学结合而染色。结合方式:离子键,共价键和氢键。

五、细胞的染色
(一)细胞核的染色
细胞核的主要化学成分是核酸和蛋白质。
蛋白质分子中的氨基酸残基含有酸性基团或碱性基团,它可以与染料分子以离子键,氢键或配价键结合。蛋白质的两性电离受环境的pH值影响。核酸包括DNA和RNA。核酸是由单核苷酸连接成的大分子。在DNA双螺旋结构中,两条核酸链上的磷酸基向外,并电离为负离子使DNA双螺旋的外侧带负电荷。因此容易和带正电荷的碱性染料以及媒染染料以离子键或氢键相结合。染色体的主要成分为呈酸性的DNA、和RNA,在染色体环境(pH为7.5-7.8),呈酸式电离,带负电,易被电离后带正电荷的碱性染料染色。核质的主要成分为碱性蛋白质,电离后带正电荷,易被负电荷的酸性染料染色。而核仁具有酸碱两性的性质。
(二)胞浆染色
胞浆的主要化学成分是蛋白质,其次是RNA和脂蛋白质等,多为两性化合物。胞浆的等电点大约在pH4.7-5.0。胞浆的染色与pH值密切相关。当pH值在3.6-4.7之间,恰好胞核带负电荷为碱性染料染色,胞浆带正电荷为酸性染料染色,使胞核和胞浆区分开来。
(三)胞膜的染色
细胞膜的主要成分为类脂和蛋白质,形成流动镶嵌脂质双层结构。膜的外表面分布有糖脂、磷脂和蛋白质,带负电荷,易被碱性染料染色。


六、媒染染料的染色
(一)媒染染料
有些染料直接对组织染色时,由于染料与组织间的作用力很弱,有时甚至无作用,因此组织着色很浅,甚至不着色。我们必须将这类染料先与媒染剂(如金属离子)结合,生成色淀再对组织进行染色。凡是能与媒染剂(如金属离子)结合生成色淀的染料称为媒染染料。
常见的媒染染料多半是天然染料,如苏木精,卡红等。
人工合成的煤焦油染料一般不需媒染剂,但有时媒染剂可加强其染色效果,提高染色的坚牢度。
(二)媒染剂
凡能和组织及染料结合,生成色淀,并促进染色的金属离子盐类或金属原子的含氧酸等称为媒染剂。媒染剂既能和染料结合,又能和组织结合,在组织与染料之间起到一个媒介的作用。
常用的媒染剂多为过渡金属元素,一至三价的可溶性盐类或氢氧化物,如铝盐、铁盐、明矾及金属含氧酸等。
(三)促染剂
促染剂是指只增强染料的染色能力,但不参与染色反应的一类物质。如美蓝染液中的氢氧化钾,伊红染液中的冰醋酸、洋红染液中的硼砂、硫堇染液中的石炭酸,金属浸润法中常用的巴比妥及佛罗那等。促染剂的作用是增强染料的染色能力,它与媒染剂的区别在于它不参加染色反应。


七、苏木精-伊红染色方法
苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法,简称HE染色方法,是细胞与组织学最广泛的染色方法。
一、HE染色的基本原理
(一)细胞核染色的原理
细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸(DNA),DNA的双螺旋结构中,两边链上的磷酸基向外,带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精硷性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。
(二)细胞浆染色的原理
细胞浆内主要成分是蛋白质,为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系,当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时,胞浆对外不显电性,此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时,大于蛋白质的等电点pH值,表现酸性电离,而带负电荷的阴离子,可被带正电荷的染料染染色,同时胞核也被染色,核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下,在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子),就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织,嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。
(三)、二甲苯的作用
烤片后切片进入二甲苯是脱蜡的作用。组织处理和染色后进入二甲苯是透明作用。组织处理的透明是为了石蜡能进入到细胞中去,染色后透明是为了使细胞的折光率与玻璃相同,以便显微镜观察。
(四)、酒精的作用
酒精用于苏木精染色前由高浓度至低浓度是为了洗脱用于脱蜡的二甲苯。
伊红染色以后的酒精由低浓度至高浓度酒精逐渐过度是为了彻底脱去组织中的水份。
(五)、水洗的作用
在脱蜡经酒精处理之后,水洗切片,是为了苏木精染液能更好的进入细胞核中去,使细胞核染色均匀。
染色之后的水洗作用是为洗去未与切片结合的染液。
分化以后的水洗则是为了除去分化液和脱下的染料,中止分化作用。
在伊红染色之后也可以水洗,是为了减少伊红染液进入脱水的酒精中。
(六)分化和蓝化作用
1、分化作用
苏木精染色之后,先用水洗去未结合在切片中的染液。然后用分化液1%盐酸酒精脱去细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料,这个过程称为染色的分化作用。
2、蓝化作用
分化之后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态,在碱性条件下则处于蓝色离子状态,而呈蓝色。所以分化之后用水洗除去酸而中止分化再用温水或弱碱性水使染上苏木精的细胞核变蓝色,称蓝化作用,以自来水浸洗或温水变蓝为佳。




参考文献:
1、王伯沄,李玉松,黄高升,张远强《病理学技术》
2、凌启波《实用病理特殊染色和组化技》
3、刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》
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