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细菌、霉菌和病毒

时间:2007-12-23  作者:丁伟  阅读:20882次

                细菌
Gram碱性复红结晶紫法
试剂配制:
(1)  苯胺油石炭酸复红液:
碱性品红0.5g,苯胺油1ml,石炭酸1g,30%酒精70ml。碱性品红溶于70ml酒精中,隔水加热至90℃,冷却后加入石炭酸和苯胺油。
(2)碘液:碘片1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml
(3)结晶紫染液:结晶紫 2g,95%酒精20ml,草酸胺1g,蒸馏水80ml。
结晶紫溶于酒精,,草酸胺溶于蒸馏水。二液混合,此液置冰箱可保存数月。
操作方法:
1、 组织固定于10%甲醛液,按常规脱水包埋。
2、 切片脱蜡至水。
3、 苯胺油石炭酸复红液5分钟。
4、 自来水冲洗,蒸馏水洗。
5、 4%甲醛1分钟,蒸馏水洗2次。
6、 苦味酸饱和水溶液处理2分钟。
7、 经过95%酒精速洗后,放入自来水中立即变红色。
8、 自来水冲洗,蒸馏水洗。
9、 碘液作用2分钟,自来水洗,用滤纸直接吸干。
10、二甲苯苯胺油等份混合,进行分化苯。
11、二甲苯透明、中性树胶封固。
结果:革兰氏阳性细菌呈蓝色,阴性细菌呈红色,细胞核呈红色。

                                     抗酸杆菌
苯酚碱性品红法:
   碱性品红酒精液:碱性品红 5克   无水酒精 100毫升
   5%苯酚水溶液: 苯酚 5毫升(略加温,使其溶解) 蒸馏水 95毫升
   苯酚碱性品红液: 碱性品红酒精液 1毫升
   5%苯酚水溶液 9毫升
染色步骤:
1. 切片二甲苯脱蜡,95%酒精速洗
2. 蒸馏水洗
3. 苯酚碱性品红液染15~30分钟
4. 蒸馏水洗
5. 2 %硫酸水溶液分化至适当为止
6. 水洗
7. 烘干,透明,封固
结果:抗酸杆菌(结核杆菌和麻风杆菌)呈红色。


                   真 菌
(一)高碘酸法复红法
亮绿液:   亮绿 0.2g        蒸馏水 100 ml       冰醋酸 0.2 ml
Schiff试剂配制:
碱性品红 1 g ,活性炭 2 g ,当量盐酸 20 ml ,偏重亚硫酸钠 1.5 g
1. 碱性品红1g,放入200毫升蒸馏水中,煮沸,搅拌,充分溶解。
2. 冷却至50℃时过滤,滤液中加入当量盐酸20毫升。
3. 加偏重亚硫酸钠 1.5 g,置于暗处过夜。
4. 加活性2 g,摇晃,过滤,以无色为最佳。棕色瓶,4℃冰箱保
   存。 

染色步骤:
1. 切片脱蜡至蒸馏水。
2. 0.5%~1%过碘酸水溶液5~10分钟。
3. 蒸馏水洗多次。
4. Schiff液10~15分钟。
5. 0.5%偏重亚硫酸钠液洗2次,每次1分钟。
6. 流水冲洗10分钟。
7. 亮绿液复染数秒钟。
8. 水洗,酒精脱水,二甲苯透明,树胶封固。
结果:真菌红色,其他组织绿色。

(二)六胺银染色法
六胺银液配制:
       3%六次甲基四胺水溶液  5 ml
       2.5%硝酸银水溶液      0.5 ml
摇晃,变清,再加2.5%四硼酸钠1.5~2 ml加蒸馏水至30~40 ml
步骤:
1、 切片脱蜡至水,蒸馏水洗
2、 0.5%高碘酸浸15分钟,蒸馏水洗
3、 六胺银液60℃,1~2小时,(或六胺银液80~90℃,半小时左右,)蒸馏水洗(镜下基底膜呈黑色)
4、 0.2% 氯化金调色数秒
5、 丽春红淡染
6、 水速洗
7、 烘干,透明,封片。
结果:肾小球基底膜呈黑色,霉菌,弹力纤维及一些网状纤维也呈黑色。

                 幽门弯曲菌(HP)
(一)HP(美蓝法)

美蓝液: 美蓝(亚甲基蓝)1. 0 g , 硼酸 0 . 5 g ,加蒸馏水至 100 ml
  步骤:
  1  切片脱蜡至水
  2  入美蓝液中1分钟
  3  水洗后烤箱烘干封固(不宜酒精脱水)
结果:  幽门弯曲菌深蓝色
优点:  试剂配制容易,染色方法简单
应用:帮助慢性胃炎、消化道溃疡的诊断及治疗。

(二)、HP(硝酸银法)
试剂配制:
(一) 醋酸缓冲贮备液,PH3.6
0.2N醋酸缓冲液,PH3.6             10 ml
蒸馏水                            240 ml
以下各液均用此液配制
(二) 1 %硝酸银液
硝酸银                            1 g
醋酸缓冲贮备液,PH3.6             100 ml 
(三) 2 %硝酸银液
硝酸银                            0.2 g
醋酸缓冲贮备液,PH3.6              10 ml
(四) 5 %明胶液
明胶                             5 g
醋酸缓冲贮备液,PH3.6             100 ml
先把醋酸缓冲贮备液加温至40℃左右,然后倾入明胶,于37℃温箱内慢慢溶解,搅拌。
(五) 3 %对苯二酚液
对苯二酚                         0.3 g
醋酸缓冲贮备液,PH3.6             10 ml
(六) 明胶对苯二酚液
3 %对苯二酚液                    1 ml
5 %明胶液                       15 ml
(七) 显影液
明胶对苯二酚液                  16 ml
2 %硝酸银液                     3 ml
  在操作到第4步完成前5分钟充分混合,置于56℃水浴箱中保温待用。
操作方法:
1、组织脱蜡至蒸馏水
2、醋酸缓冲贮备液洗2次
3、入1 %硝酸银液中,56℃,1小时
4、切片不水洗,直接放入预热的显影液中56℃,肉眼呈黄棕色为止。
5、倾去显影液,于56℃的水中浸洗2分钟
6、水洗
7、 脱水,透明,封固。
8、 结果:幽门弯曲菌呈棕黑至黑色。
注意:载玻片不能用粘贴剂或用硅化玻片

                     新型隐球菌
(一)、爱先蓝法(根据Steedman,1950;Lison,1954)
试剂配制:
(1)爱先蓝水溶液(pH2.5):爱先蓝(alcian blue 8GX)1g,蒸馏水97ml,冰醋酸3ml,麝香草酚50mg(可不加)
(2)核固红液:核固红(nuckear fast red)0.1g,蒸馏水100ml,硫酸铝5g,麝香草酚50mg(可不加)
先把硫酸铝溶于蒸馏水,然后加入核固红,稍加温溶解,冷却后过滤,最后加入麝香草酚(可不加)。
操作方法:
1、 组织固定于10%甲醛液,按常规脱水包埋。
2、 切片脱蜡至水。
3、 爱先蓝染液染10-20分钟。
4、 水洗。
5、 核固红液复染5-10分钟。
6、 水洗。
7、 常规脱水透明,中性树胶封固。
结果:新型隐球菌的荚膜呈蓝色,胞核红色。

(二)粘液胭脂红法(根据Southgate改良Mayer,1927)
试剂配制:
Southgate粘液胭脂红贮备液:胭脂红(carmine)1g,无水酒精50ml,蒸馏水50ml,氢氧化铝,0.5g
用烧杯放入无水酒精和蒸馏水,使其混合成50%酒精,依次加入胭脂红等,用玻璃棒搅拌混和,于水浴中煮沸3分钟,并不断搅动。

待冷至室温后过滤,并用50%酒精加至100毫升。临用前取贮备液1份,蒸馏水4份混合使用。也可直接用贮备液来染色。
操作方法:
1、 切片脱蜡至水。
2、 用苏木素染核。
3、 自来水洗。
4、 1%盐酸酒精分化。
5、 流水冲洗10分钟。
6、 Southgate粘液胭脂红稀释液染20-30分钟。
7、 水洗去多余染液。
8、 常规脱水透明,中性树胶封固。
结果:新型隐球的荚膜染成红色,胞核蓝色。


                                乙型肝炎表面抗原
(一)地衣红法(根据(Shikata,1974)

试剂配制:
(1) 酸化高锰酸钾水溶液:
甲液:0.5%高锰酸钾水溶液高锰酸钾0.5g,蒸馏水加至100ml
乙液:0.5%硫酸水溶液:纯硫酸0.5ml,蒸馏水99.5ml
甲、乙两液分瓶装,临用前等份混合。
(2)2%草酸水溶液:草酸2g,蒸馏水加至100ml
(3)酸化地衣红酒精液:地衣红(orcein)1g,70%酒精100ml,盐酸1ml
先将浓盐酸倾入70%酒精中,然后加入地衣红,混合后用玻棒搅动,使其尽量溶解,其pH值相当于1.0,放置1-2天后即可使用。
操作方法:
1、 切片脱蜡至水。
2、 酸化高锰酸钾水溶液氧化5分钟。
3、 水洗。
4、 2%草酸液漂白2-3分钟,至切片无色为止。
5、 流水冲洗2-3分钟。
6、 70%酒精稍洗。
7、 置入酸化地衣红酒精液内染3-5小时。
8、 70%酒精浸洗二次,每次约10-30秒钟,至无染液脱出为止。
9、 常规脱水透明,中性树胶封固。
结果:肝细胞内的乙型肝炎表面抗原染成棕红至深棕色,呈微细颗粒状或无质状。弹性纤维也染为深棕色,其余底色为较浅淡的灰

棕色。肝细胞核不着色。

(二)、醛品红法(根据Gomori,1950)
试剂配制:
(1) 酸化高锰酸钾水溶液:
甲液:0.5%高锰酸钾水溶液高锰酸钾0.5g,蒸馏水加至100ml
乙液:0.5%硫酸水溶液:纯硫酸0.5ml,蒸馏水99.5ml
甲、乙两液分瓶装,临用前等份混合。
(2)2%草酸水溶液:草酸2g,蒸馏水加至100ml
(3)醛品红染液:碱性品红0.5g,70%酒精95ml,浓盐酸1ml,三聚乙醛1ml
     将碱性品红溶解于70%酒精,然后加浓盐酸和三聚乙醛1ml,慢慢摇动使之均匀混合,24小时后可以使用。
操作方法:
1、 切片脱蜡至水。
2、 酸化高锰酸钾水溶液氧化5分钟。
3、 水洗。
4、 2%草酸漂2-3分钟,至切片无色为止。
5、 流水冲洗2-3分钟。
6、 70%酒精稍洗。
7、 置入醛品红液内梁5-10分钟。
8、 70%酒精浸洗二次,每次约10-30秒钟。
9、 、常规脱水透明,中性树胶封固。
结果: 肝细胞的乙型炎表面抗原被染为紫至深紫色,弹力纤维深紫色。

(三)、维多利亚蓝法(1981)
试剂配制:
(1) 维多利亚蓝染液:维多利亚蓝(victoria blue)2g,糊精(dextrin)0.5g,间苯二酚(resorcin)4g,蒸馏水200ml
取一只500ml烧杯,加入蒸馏水,再把维多利亚蓝、糊精和间苯二酚加入溶解,在慢火中煮沸,然后再用另一只烧杯煮沸30%三氯化

铁液25毫升,慢慢倒入维多利亚蓝混合液中,继续煮沸3分钟,不断搅拌呈胶体物。冷却后过滤,将沉渣和滤纸放在60℃烧箱内烤干

。取另一只烧杯盛70%酒精400毫升溶解沉渣,然后加入冰醋酸4毫升和苯酚6克作防腐剂,放置一周成熟后使用。
(2) 酸化高锰酸钾水溶液:
甲液:0.5%高锰酸钾水溶液高锰酸钾0.5g,蒸馏水加至100ml
乙液:0.5%硫酸水溶液:纯硫酸0.5ml,蒸馏水99.5ml
甲、乙两液分瓶装,临用前等份混合。
(3)2%草酸水溶液:草酸2g,蒸馏水加至100ml
(4)核固红染液:核固红0.1g,5%硫酸铝水溶液100ml
       将核固红溶于硫酸铝水溶液中,加温煮沸后冷却,过滤备用。
操作方法:
1、 切片蜡至水。
2、 酸化高锰酸钾水溶液氧化5分钟。
3、 水洗。
4、 2%草酸液漂白2分钟。
5、 流水冲洗5分钟。
6、 70%酒精稍洗。
7、 置入维多利亚蓝液内染24-48小时。
8、 70%酒精浸洗二次,每次约1-3分钟,至切片不有染液脱出为止。
9、 流水稍冲洗。
10、 核固红液染核5-10分钟。
11、 水洗。
12、 常规脱水透明,中性树胶封固。
结果:肝细胞内的乙型肝炎表面抗原呈蓝色,弹力纤维和胶原纤维也着染蓝色,胞核红色。




参考文献:
1、王伯沄,李玉松,黄高升,张远强《病理学技术》
2、凌启波《实用病理特殊染色和组化技》
3、刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》
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