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增强免疫组化特异性染色的方法

时间:2007-12-23  作者:丁伟  阅读:18953次

 1、抗原修复
其作用是利用化学试剂和热的作用暴露抗原,增加细胞和组织的通透性,以便抗体与抗原最大限度的结合,增大强特异性染色和避免非特异性染色。
(1)、酶修复:常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶以及链霉蛋白酶等;酶消化的时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同,应根据酶的活性通过预试验确定,消化的时间还与组织固定的时间有关,一般是陈旧固定组织所需时间长,以37℃为宜。消化时间短的组织可在室温中进行。消化处理时间过长会损伤组织,易使切片脱落,应使用切片粘附剂,消化时间尽量缩短。
(2)、热修复:
A.真空负压抗原修复法:
把切片放在0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)内,真空负压干燥箱预先调至95℃,真空负压处理10分钟, 待修复液降至室温,PBS洗次。
  B.微波加热抗原修复法:
     把切片放在0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)内,用微波炉加热10-20分钟(如液体减少,必须补加),待修复液降至室温后,PBS洗次。
C.高压抗原修复法:
把切片放在0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)内,放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续2-3分钟。待修复液恢复至室温后,PBS洗次。
D.隔水热抗原修复法:
切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH0.6)中,加热至沸腾,持续30分钟。待抗原修复液恢复至室温后,PBS洗次。
E.电炉加热抗原修复法:
切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH0.6)中,于电炉上加热,,加热至沸腾,持续至20-30分钟。待抗原修复液降至室温后,PBS洗次。

2、合适的抗体稀释度
抗体的浓度是免疫染色的关键,如果抗体浓度过高,抗体分子过多于抗原决定簇,可导致抗体结合减少,产生阴性结果。此阴性结果并不一定是缺少抗原,而是由于抗体过量,这种现象类似于凝集的应中前带效应。因此,必须使用一系列稀释作“棋盘式效价滴定”,检测抗体的合适稀释度,以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。


3、温育时间
大部分抗体温育时间为30-60分钟,必要时可4℃过夜。温育的温度常用37℃,也可在室温中进行。37℃可增强抗原抗体反应,适用于多数抗原染色,应注意在温盒中进行,防止切片干燥而导致失败。


4、多层染色法
对弱的抗原可用间接法(双层)、PAP和ABC法(三层)、四或五层PAP法或ABC法,或PAP和ABC联合染色法等,可以很大程度的提高敏感性,获得良好结果。


5、其他增敏方法
如微波处理方法,TAS增敏方法以及免疫PCR方法。




参考文献:
1、王伯沄,李玉松,黄高升,张远强《病理学技术》
2、凌启波《实用病理特殊染色和组化技》
3、刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》
本栏目内容只供网友们学习研究用,不得用于商业行为。

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