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FISH和PRINS技术

时间:2007-12-23  作者:丁伟  阅读:16915次

一、荧光原位杂交(FISH)
  是一种简单、敏感、而容易操作的方法,结果迅速,并能在同一标本上检测多个不同的基因,可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片。
FISH技术是利用特异的DNA探针,标记了生物素,地高辛、或荧光素,对检测细胞进行DNA-DNA原位杂交,并用荧光法显示。
(FISH)实验步骤
试剂配制:
(1)变性液(70%甲酰胺 + 2×SSC,pH7.0):4ml 20×SSC;8ml蒸馏水;28ml甲酰胺。每次新鲜配制。
     (2)杂交后洗涤液: 20×SSC 4ml;蒸馏水16ml;甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。

    1、用硅化玻片,石蜡切片,60℃烤片过夜。二甲苯脱蜡至酒精,斜置切片,空气中干燥。
    2、蛋白酶处理:
     1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40ml倒人Facal管,在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内,摇动直到酶溶解。
     2) 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
     3) 2×SSC在室温下漂洗切片3次,每次1min。
     4)梯度酒精脱水(-20℃预冷),空气中干燥。
    3、变性:
     1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液;
     2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸;
     3)78℃孵育8min;
     4) 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min,再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内,每缸2min;
     5)空气干燥。
  
  4、杂交:
     1)准备探针;
     2)取一个较大的湿盒,交叉放置切片;
     3)滴10μl探针在切片的组织上,加盖玻片;
     4)盖上湿盒盖,37℃孵育12h~16h。
     杂交后水洗:
     5)镊子小心去除盖玻片;
     6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min;
     7)2×SSC(37℃)洗两次,每次10min;
     8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测,勿使切片干燥。
     检测:
     9)从1×PBS中取出切片,除去过多的水分,避免标本干燥。把切片放入湿盒内,同时处理4张切片。
     10)每张切片使用30μl~60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素,室温下孵育20min;
     11)去掉塑料盖膜,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次,每次2min。
扩增:
     12)从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出;
     13)每张切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20min;
     14)去掉塑料盖膜,把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次,每次2min;
     15)从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出;
     16)每张切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20min;
     17)1×PBS室温下洗3次,每次2min。
    5、细胞核染色:
     1)张切片加10μl~20μl DAPI,覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5ml;
     2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
 
二、用引物介导的原位标记(PRINS)
是PCR和荧光原位杂交(FISH)的结合, PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列,在聚合酶的驱动下,带有标记的脱氧核苷酸(FITC-dUTP或半抗原-dUTP)和dATP、dCTP、dGTP的延伸,依赖标记,新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC,用荧光显微镜观察。
PRINS实验步骤
    1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS;
    2、用0.2mol/L盐酸处理5min;
    3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min;
    4、分别用80%,95%和100%酒精脱水,室温干片;
    5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,各加200μmol/L dATP,dCTP,dGTP,1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl,引物250ng,Taq DNA聚合酶2U),加盖片;
    6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min;
    7、用0.1×SSC液,65℃洗5min;
    8、片于65℃ 10s~20s;用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5min,2次;
    9、经Buffer I液洗后滴加20%羊血清封闭30min;
    10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h;
    11、BufferⅢ液洗5min;
    12、用BCIP-NBT显色1h~2h,在镜下控制,终止显色;
    13、用中性红或核固红衬染,酒精脱水,二甲苯透明,树脂封片




参考文献:
1、王伯沄,李玉松,黄高升,张远强《病理学技术》
2、凌启波《实用病理特殊染色和组化技》
3、刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》
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